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分别采用辛酸硫酸铵法(CAAS)、硫酸铵沉淀法(AS)和DEAE离子交换层析法对小鼠IgG腹水进行了纯化效果的比较.结果表明: CAAS法提取IgG的纯度为67-5﹪,高于AS法(43-2﹪),低于DEAE法(100﹪);CAAS法提取IgG的回收率为51-2﹪,远高于DEAE(8-9﹪),略低于AS法(63-8﹪).将不同纯化方法获得的IgG定容至相同浓度.ELISA试验结果表明EAE法的OD值明显降低,表明DEAE纯化方法降低了IgG的免疫学活性.说明CAAS法是一种操作简单 、成本低 、纯化效果和回收效果较佳的提取小鼠腹水IgG的首选方法.
阴离子交换层析法纯化gp130单克隆抗体B-S12
Purification of monoclonal antibody B-S12 from mouse ascites by strong anion exchange liquid chromatography
<<中国免疫学杂志 >>2006年08期
马泓冰 , 徐颖 , 夏瑜 , 朱一蓓 , 庄羽美 , 郁健峰 , 张学光
目的:建立一种从小鼠腹水中获得高纯度、活性好、纯化过程易于放大的抗gp130单克隆抗体B-S12的纯化方法.方法:经硫酸铵沉淀等预处理后的腹水样品,在阴离子交换层析柱上进行分离纯化,用MTT法检测纯化后抗体的生物学活性.结果:腹水样品经硫酸铵沉淀 、PBS复溶,用pH 7.0 、20 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液稀释10倍后上强阴离子交换层析柱,NaCl梯度洗脱,可获得纯度大于95﹪的B-S12抗体,回收率达73﹪,在体外对XG-2细胞有明显的促增殖作用.结论:建立了快速高效从小鼠腹水中纯化B-S12的方法,为该抗体的进一步应用提供了必要的实验基础.
2006年 10期《黑龙江畜牧兽医》
Heilongjiang Animal Science And veterinary Medicine
起止页码：14-16
国际标准刊号：ISSN 1004-7034
国内统一刊号：CN 23-1205
小鼠腹水IgG类单克隆抗体纯化方法的研究
周玉[1] 李岩松[2] 潘风光[2] 谭建华[3] 柳增善[1] 王哲[4]
摘 要:分别采用辛酸-硫酸铵法（CA—AS）、硫酸铵沉淀法（AS）和DEAE离子交换层析法对小鼠IgG腹水进行了纯化效果的比较 。结果表明：CA—AS法提取IgG的纯度为67．5％，高于AS法（43．2％） ，低于DEAE法（100％）；CA—AS法提取IgG的回收率为51．2％ ，远高于DEAE（8．9％），略低于As法（63．8％）。将不同纯化方法获得的IgG定容至相同浓度。ELISA试验结果表明：DEAE法的OD值明显降低 ，表明DEAE纯化方法降低了IgG的免疫学活性 。说明CA—AS法是一种操作简单 、成本低 、纯化效果和回收效果较佳的提取小鼠腹水IgG的首选方法 。[著者文摘]
关键词:小鼠腹水IgG 辛酸 硫酸铵 离子交换层析
小鼠腹水抗体的制备
1．抗原的处理与小鼠腹水粗抗体的收集
现在以B亚基的抗体制备为例说明：
取2mg的蛋白 ，溶于100?l的10％SDS中，加入等体积的上样缓冲液 ，沸水浴3min ，进行SDS－PAGE。
将胶的两边缘切带染色，脱色后在相应的位置从分离胶上切下未染色目的蛋白带 ，无菌水洗涤 ，用匀浆器匀浆后，再在2～5mM的PBS中透析5h以上 ，冷干 。
将冷干的样品用500～800?l 的2mM～5mM的PBS溶解（得到体积约600～1000?l）,加入等体积的弗氏完全佐剂 ，大约乳化2h～3h 。确保乳化完的蛋白浓度为0.5~1.0mg/ml。将乳化好的混合液用1ml的一次性注射器注射小鼠，每只50～100?l，即50～100?g的抗原蛋白 。
第一次加强注射：10～14天后将制备的样品用弗氏不完全佐剂乳化 ，同样注射小鼠 。
第一次加强注射后10天左右 ，用小鼠的血清，通过酶联免疫的方法（ELISA）测定腹水抗体效价来检测抗体的存在。
第二次加强注射：如果ELISA得到阳性的结果 ，用弗氏不完全佐剂乳化抗原 ，再次注射小鼠，并在注射后的2～3天后注射H22腹水瘤细胞 ，每次注射量再1.5×106~2.0×106个细胞 ，7天后产生腹水 。如果两周后小鼠仍无腹水，再次注射抗原以及瘤细胞 。
收集腹水 ，每只小鼠可以收集几次 ，每次3～10ml不等，收集腹水至小鼠死亡。腹水中加入0.01%的叠氮化钠以防止长菌 ，再在12000rpm离心2次 ，保留上清 。测定效价后，进行抗体的纯化，分装 ，－70°C保存 。
[注]：（1）在SDS-PAGE时 ，分离胶中加入300?l SDS，浓缩胶中加入200?l SDS ，以确保SDS足量。
（2）在制备蛋白样品过程中会损失一部分抗原大约25％～50％
（3）收集的小鼠腹水要分装到小指管中 ，不同的小鼠产生的腹水效价不同，做好标记。
2．抗体纯化
用1/10体积的1.0mol/L Tris(pH8.0)调节粗制抗体的pH值 。
用0.1mol/L Tris(pH8.0)平衡柱子 。
将抗体溶液用蛋白G微珠层析柱过滤 ，每次上2ml的样品。
用10倍体积的0.1mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠 。
用10倍体积的0.01mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠 。
用2ml的50mmol/L 甘氨酸(pH3.0)洗脱滤柱。收集洗脱峰于装有1/10体积的1.0mol/L Tris(pH8.0)的试管内 ，轻轻摇匀 。
用10倍体积的0.1mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠 。重复以上过程。
测定蛋白浓度，并进行SDS-PAGE检测抗体的纯度 。
[注]：配Tris与甘氨酸溶液用盐酸来调pH值
3．酶联免疫检测抗体的效价（ELISA）
用包被液稀释抗原至50～100?g/ml ，加入酶标板中 ，每孔100?l ，4°C过夜
用洗涤液清洗酶标板3次 ，每次在摇床上摇5min～8min ，37°C下用封闭液封闭酶标板4h以上 。
待测的腹水抗体按1：1000～1：128000稀释，分别加入孔中，每孔100?l ，37°C孵育2h ，再用洗涤液清洗3次。
将辣根过氧化物酶标记的二抗按照1：1000稀释，每孔加入每孔100?l ，37°C孵育1h ，再洗涤3次 。
加入辣根过氧化物酶显色液100?l，显色5min后 ，加入终止液100?l ，终止显色 。
以不注射抗原的小鼠腹水为阴性对照（也要相应于含抗体的腹水稀释），以只加显色液与终止液的孔为空白对照 ，用酶标仪测定492nm波长下的吸收值 ，确定抗体的效价。
所用试剂：
包被液：0 .50g Na2CO3，0.4g NaHCO3 ，200ml ，pH9.6
PBS ：10mmol/LNaH2PO4, 10mmol/LNa2HPO4,150mmol/LNaCl，pH7.4
封闭液：3％BSA溶于PBS中
洗涤液：0.05~0.1％Tween-20溶于PBS中
底物缓冲液：0.1mol/L柠檬酸，0.2mol/LNa2HPO4 ，pH5.0 ，用时每10ml的缓冲液加入4mgOPD(邻苯二胺)以及20?l 30％H2O2
终止液：2mol/L H2SO4
[注]：（1）在洗涤时应当确保充分，否则会出现阴性对照的值偏大。
（2）空白对照最好做一排孔（8个或12个） 。
（3）底物缓冲液要现用现配 。
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